悬浮态上皮细胞粘附的力学-化学耦合模型及数值模拟 1)

悬浮态上皮细胞粘附的力学-化学耦合模型及数值模拟 ¹⁾

冯世亮^,^*^,²⁾,周吕文^*,吕守芹^†^,^**,龙勉^†^,^**

^*宁波大学机械工程与力学学院, 浙江宁波315211

^†中国科学院力学研究所生物力学与生物工程中心、中国科学院微重力重点实验室, 工程化构建与力学生物学北京市重点实验室, 北京100190

^**中国科学院大学工程科学学院, 北京100049

MECHANOCHEMICAL COUPLING MODEL AND NUMERICAL SIMULATION FOR CELL-CELL ADHESION IN SUSPENDED EPITHELIAL CELLS ¹⁾

Feng Shiliang^,^*^,²⁾,Zhou Lüwen^*,Lü Shouqin^†^,^**,Long Mian^†^,^**

^*Ningbo University College of Mechanical Engineering and Mechanics, Ningbo 315211, Zhejiang, China

^†Center of Biomechanics and Bioengineering, Key Laboratory of Microgravity (National Microgravity Laboratory), and Beijing Key Laboratory of Engineered Construction and Mechanobiology, Institute of Mechanics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

^**School of Engineering Science, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

通讯作者:2)冯世亮, 讲师, 研究方向: 细胞-分子力学, 植物力学. E-mail:fengshiliang@nbu.edu.cn

收稿日期:2020-01-10接受日期:2020-02-27网络出版日期:2020-05-18

基金资助:

1)国家自然科学基金 . 11502272
国家自然科学基金 . 11972200

Received:2020-01-10Accepted:2020-02-27Online:2020-05-18

作者简介 About authors

摘要

上皮细胞通过局部募集上皮性钙粘附蛋白 (E-cadherin) 建立胞间粘着连接, 实验证实该过程受到肌球蛋白皮层张力的调控. 为了从系统层面阐明粘着连接形成动力学过程, 本文考察皮层张力调控肌动蛋白 (F-actin) 解聚从而参与E-cadherin级联转导, 同时以马达-离合器机制模拟两细胞相互作用, 据此构建可反映悬浮态细胞粘附的力学-化学耦合数学模型; 对整体包含随机点源的非线性反应-扩散方程组与平衡微分方程耦合系统采取了自行发展的格子Boltzmann-粒子法与蒙特-卡洛法数值求解. 数值模拟表明, 由收缩性肌球蛋白 (myosin-II) 拉动胞间E-cadherin成键可提升皮层张力, 进而降低F-actin解聚速率﹑锚定更多的E-cadherin; 所构成的力学反馈回路展现出时空效应, 可帮助E-cadherin在接触区建立初始极性; E-cadherin形成顺式二聚体则将初始极性放大, 导致接触区E-cadherin展现起始、快速增长及慢速增长的积聚动力学特征. 皮层呈松散结构时刚度较小, 可通过延长胞间E-cadherin成键寿命提升张力, 而接触区弧度适中时($\approx$1.2 rad) E-cadherin峰值最高; 两者可分别作为启动力学反馈回路及调控粘着连接成熟度的有效手段.

关键词： 粘着连接 ; 数学模型 ; 格子玻尔兹曼

Abstract

Epithelial cells develop adherens junctions via local recruitment of a transmembrane receptor, named E-cadherin, whose activity is dependent on Ca$^{2+}$ signal. Growing evidences indicate the importance of tensile forces within actomyosin cortex, yet a system-level understanding for the mechanosensitive responses of cell-cell contacts remains unclear. Here, we constructed a mechanochemical coupling model, in which the tensile forces presented at adherens junctions participated in the interactions between myosin contractility, actin dynamics and local E-cadherin recruitment, which together, formed a mechanical feedback loop (MFL). The mechanical interactions between a pair of epithelial cells were treated by a motor-clutch mechanism. The in-house developed lattice-Boltzmann particle (LBP)-D1Q3 method, which had been embedded with a simple Monte-Carlo method, was adopted to solve the coupled nonlinear reaction-diffusion equations, which had stochastic reaction terms, and were coupled with the equilibrium differential equation. The numerical simulation results indicate that the spatiotemporal effects of MFL may arise an initial anisotropy in the distribution pattern of E-cadherin, which could be further amplified by "cis" interactions between E-cadherins from the same cell surface. The model thus confirms three distinct phases in the profile of E-cadherin accumulation at the center of contact zone, which are initial, rapid increase, and slowly increase, as observed experimentally. Furthermore, local recruitment of E-cadherin can be mechanically regulated by either the elastic modulus of actomyosin cortex or the extent of cell-cell contact, whereupon the highest E-cadherin density takes place at 1.2 rad. Accordingly, decreasing the elastic modulus of actomyosin cortex may thus act as a triggering mechanism for MFL while the length of cell-cell contact is denoted as a controller of the maturity of adherens junctions.

Keywords： adherens junctions ; mathematical model ; lattice Boltzmann

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本文引用格式

冯世亮, 周吕文, 吕守芹, 龙勉. 悬浮态上皮细胞粘附的力学-化学耦合模型及数值模拟 ¹⁾ .力学学报[J], 2020, 52(3): 854-863 DOI:10.6052/0459-1879-20-011

Feng Shiliang, Zhou Lüwen, Lü Shouqin, Long Mian. MECHANOCHEMICAL COUPLING MODEL AND NUMERICAL SIMULATION FOR CELL-CELL ADHESION IN SUSPENDED EPITHELIAL CELLS ¹⁾ . Chinese Journal of Theoretical and Applied Mechanics [J], 2020, 52(3): 854-863 DOI:10.6052/0459-1879-20-011

引言

上皮细胞 (epithelial cells) 彼此借助粘着连接(adherens junctions, AJs) 形成连续上皮组织, 由此发挥屏障、增殖调控等生理功能^[1-2]. 上皮性钙粘附蛋白 (E-cadherin, E-cad) 作为一种跨膜蛋白, 是调控AJs形成的核心分子机制^[3]. 一方面, E-cad胞外结构域在Ca$^{2+}$参与下, 在胞间或同一细胞表面分别形成反式/顺式二聚体 (trans-/cis-dimerization)^[4], 其胞质结构域则借助 $\alpha $, $\beta $连环蛋白 ($\alpha $-, $\beta $-catenin) 与肌动蛋白 (F-actin) 锚定^[5]; 另一方面, 胞间E-cad成键引起Rac, Cdc42等Rho家族小G蛋白 (Rho GTPase) 激活^[6], 进而激活下游F-actin结合蛋白 (例如: Arp2/3, myosin-II, $\alpha$-actinin), 调控肌球蛋白皮层 (actomyosin cortex) 动态重组^[7-9], 由此将更多E-cad募集至细胞接触区域, 促使AJs成熟^[10].

近年来, 随着体外重构 (in vitroreconstitution)、活细胞成像等实验手段的广泛应用, 研究者愈渐认识到皮层张力对于AJs建成起整合性调控作用. Murrell 等^[11]将F-actin积簇于脂质双层膜表面, 再加入$\alpha$-actinin、myosin-II, 由此可体外重构出actomyosin皮层结构; 该实验借助改变F-actin结合蛋白的密度控制皮层流变属性, 通过检测F-actin持续长度论证了F-actin屈曲及皮层松散结构可有效增强收缩应变. Wu等^[12]对AJs上粘着小带 (zonula adherens, ZA) 及侧边区域 (lateral junctions) 进行激光烧灼, 观测到前者回缩速率明显高于后者, 说明ZA区域维持着较高张力. Leerberg等^[9]将myosin常规轻链基因 (MRLC-DD) 转入Caco-2 细胞, 使之表达myosin-II磷酸化突变体以提升皮层张力, 最终通过靶向实验验证了以$\alpha$-catenin受力打开VH2结构域、从而募集vinculin为主体的张力敏感型F-actin聚合机制. Engl 等^[13]将悬浮态S-180细胞置入非粘附微井 (microwell) 之中, 采取3D成像观测细胞接触区域E-cad募集, 同时以F-actin解聚/稳定试剂 (Latrunculin/Jasplakinolide) 处理细胞进行对照组实验; 观测到两类经处理细胞均呈现低张力状态, Jasplakinolide 对照组依然发生E-cad局部募集, 说明张力通过降低F-actin解聚速率调控E-cad.

综合上述实验, E-cad胞间成键使细胞皮层局部张力增强, 进而降低F-actin解聚速率(亦或提高局部F-actin聚合速率). 考虑到F-actin局部积聚能锚定更多E-cad, 那么由"E-cad $\to$ 张力 $\to$ F-actin"力学反馈回路所展现出的时空效应是否驱动了E-cad局部积聚, 进而调控AJs形成动力学? 为此, 本文构建了悬浮态上皮细胞粘附的力学-化学耦合模型, 并采用格子Boltzmann-粒子(LBP) 法开展数值模拟. 模拟获得了悬浮态细胞相互挤压时的E-cad, F-actin等分子时空调控特征并与Chu等^[14]实验对比, 继而探讨了细胞局部力学属性、细胞间挤压程度对于AJs的调控作用.

1 模型和方法

整体计算模型如图1(a) 所示. 考虑细胞为环状结构, 圆环代表细胞膜(指质膜及皮层紧密贴合体), 内部为胞质区域, 忽略细胞核等胞内细胞器; 将细胞膜划分为非接触及接触区域, 前者直接设定为由黏壶与弹簧并联的黏弹性单元, 后者需额外考察细胞间相互作用. 为考察分子沿可变形的细胞膜输运引入了自适应性D1Q3单元, 其长度与力学单元动态匹配; 胞质内分子浓度均一, 可由质量守恒定律直接获得.图1(b) 展示皮层张力调控F-actin解聚, 而F-actin通过锚定E-cad参与级联转导, 由此循环往复构成了力学反馈回路.图1(c) 展示采用马达-离合器 (motor-clutch) 机制^[15]考察细胞在相互接触区的力学作用. 整体数学模型由3个模块构成: 细胞力学模块、E-cad/E-cad* 调控模块 (*号表明已与F-actin锚定) 及F-actin聚合/解聚模块. 各模块的基本假设及控制方程如下.

图1

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图1(a) 细胞离散模型. 黏弹性单元与D1Q3单元 (1维LBM单元, 包含3个速度分量) 动态匹配. (b) 力学反馈回路示意图. (c) 马达-离合器机制^[15]

Fig.1(a) Discrete cell model. Each visco-elastic element is co-localized with a D1Q3 element (a) 1D LBM element with 3 discrete velocity components). (b) Schematic of mechanical feedback loop. (c) Motor-clutch mechanism^[15]

1.1 细胞力学模块

考察悬浮态上皮细胞具有均匀的力学属性, 离散细胞模型上任意单元节点$i$的受力满足以下平衡微分方程

(1)$\frac{\partial (E_1 +E_{b} +E_{s} )}{\partial x}+F_{{vis},i} +F_{{drag},i}+F_{{ext},i} =0$

上式中, 第一项是保守力, 由能量函数 ($E_{v} )$ 对位置坐标 ($X)$求偏导获得

(2a)$E_{l} =\frac{1}{2}\sum\limits_{i=1}^n ( \frac{l_i -l_0 }{l})^2$

(2b)$E_{b} =\frac{1}{2}\sum\limits_{i=1}^n {K_{b} \tan ^2\left( {\frac{\theta _i-\theta _0 }{2}} \right)^2}$

(2c)$E_{s} =\frac{1}{2}K_{s} \left( {\frac{s-s_{e} }{s_{e} }} \right)^2$

式(2a) 计算拉伸势能 ($E_{l}$), $l_i $是$i$单元实际长度, $l_0$是平衡长度, $K_1$是弹簧刚度系数; 式(2b) 计算弯曲势能 ($E_{b} )$, $\theta _i $是第$i$个弹簧角度, $\theta _0$是平衡角度, $K_{b}$是弹簧弯曲刚度; 式(2c) 计算面积约束势能 ($E_{s} )$, $s$和$s_{e}$分别是细胞当前面积及平衡面积, $K_{s}$是罚系数 (penalty coefficient), 取$K_{s} \gg \max (K_1 ,K_{b} )$ , 将细胞面积变化控制在1${\%}$. 第二项考察单元节点$i$和$j$受到与节点相对速度相反的黏性力, $F_{{vis},i}=-\gamma (v_i -v_j )$, $\gamma $是黏性系数. 第三项是细胞接触区摩擦阻力, $F_{{drag},i} =-\mu v_i $, $\mu$为动摩擦系数, 第四项即为外力项.

1.2 E-cad/E-cad*调控模块

E-cad ($E_{m}$ ) 沿细胞膜扩散并借助F-actin锚定为E-cad* ($E_{I}$ ), E-cad*又可局部形成顺式二聚体. 该过程可通过非线性反应-扩散方程组描述为

(3a)$\frac{\partial E_{I} }{\partial t}=D_{I} \nabla ^2E_{I}+(\alpha wE_{m} -\beta E_{I} )+\frac{\vartheta E_{I}^2}{K_{E}^2 +E_{I}^2 }E_{m}$

(3b)$\frac{\partial E_{m} }{\partial t}=D_{m} \nabla ^2E_{m} -(\alpha wE_{m} -\beta E_{I} )-\frac{\vartheta E_{I}^2 }{K_{E}^2 +E_{I}^2 }E_{m}$

式(3a) 中, 右侧第一项是扩散项, $D_{I} $是E-cad*在细胞膜上扩散系数; 第二项体现F-actin介导E-cad、E-cad*相互转化源项, $w$是F-actin密度, $\alpha $及$\beta$分别为E-cad与F-actin结合及E-cad*还原成E-cad速率; 第三项体现E-cad*通过形成顺式二聚体对自身密度反馈, $\vartheta $是反馈速率, $K_{E} $是饱和系数. 式(3b) 中, $D_{m} $是E-cad扩散系数 ($D_{m} >D_{I} )$, 后两项与式(3a)符号相反是基于E-cad*与E-cad总质量守恒. E-cad*在胞间成键可采用受体-配体结合方程予以描述.

(4)$R+L\mathop\rightleftarrows\limits_{k_-}^{k_+}RL$

式中, $R$和$L$分别代表受体、配体, $RL$为受配体复合物.

依据马达-离合器机制^[15], 单个马达分子与F-actin结合可施加的力为$F_{m} $, 驱动F-actin以速率$v_{m} $回缩, 同时引起E-cad*成键受拉. $t_0 $时刻, 假设节点$j$上有$n_{{c},j}$个E-cad* 成键、$n_{{m},j} $个与F-actin结合的myosin-II, 该节点所受力$F_{{C},j} $满足

(5)$F_{{C},j} =\sum\limits_{i=0}^{n_{{c},j}} F_{{c},i}=K_{c} \sum\limits_{i=1}^{n_{{c},j}} x_{{c},j}=k_{l} x_{{s},j}$

式中, $F_{{c},i} $是第$i$个键上的拉伸力, 等于该键净拉伸量 ($x_i )$与键刚度 ($K_{c} )$ 乘积; $F_{{C},j} $与此处皮层张力平衡, 可由节点位移$x_{{s},j} $、皮层刚度$K_1 $计算. $t_0 +1$时刻, 根据Bell模型更新第$i$个键的解离系数

(6)$k_{{off}}^{t_0 +1} =k_{{off}}^0 \exp \left( {\frac{F_{{c},i}}{F_{b} }}\right)$

式中, $F_{b} $是特征断裂力, $k_{{off}}^0 $是0载荷时的解离系数. 随后依据力-速度 (force-velocity) 关系^[15]更新回缩速率

(7)$v_{{m},j}^{t_0 +1} =v_{m} \left( {1-\frac{F_{{C},j} }{n_{{m},j} F_{m} }} \right)$

1.3 F-actin聚合/解聚模块

单根F-actin在刺端 (pointed end) 解聚为单体 G-actin, 用以供给钩端 (barbed end) 聚合, 从而以"踏车"(treadmilling) 的方式更新^[16-17]. 细胞接触区域 Rac 信号增强, 通过激活Arp2/3产生新的钩端, 使得接触区F-actin聚合速率加快, 由此将单根 F-actin的"踏车"行为扩展至全局. 简便起见, 将活性态Rac信号 ($\tilde{{R}})$ 考虑为以接触中心 ($Ct$) 起始, 呈指数衰减函数, 即

(8)$\tilde{{R}}(i)=R_{r} +\frac{R_{h} -R_{r} }{e}{e}^{1+5x_i }$

式中, $R_{h} $, $R_{r} $分别为细胞前端、后部 Rac活性系数, $x_i$为$i$节点到细胞前部水平距离.

F-actin ($w)$、钩端 ($B)$ 密度随时空调控可描述为

(9a)$\frac{{d}w}{{d}t}=D_{I} \nabla ^2w+vgB-d_{F} w$

(9b)$\frac{{d}B}{{d}t}=D_{I} \nabla ^2B+\tilde{{R}}a_{m} +k_{b} -cB$

式(9a) 中, 右侧第一项表征F-actin在细胞膜上缓慢扩散, 第二项为F-actin聚合反应项, $v$是单个钩端聚合G-actin (密度为$g)$速率; 第三项是受张力调控F-actin 解聚, 取$d_{F} =d_{{max}} -d_\tau \lt(\frac{F_\tau ^2 }{F_{{half}}^2 +F_\tau ^2 })$, $d_{{max}} $为最大解聚速率. $F_\tau \approx 0$时, $d_{F} \approx d_{{max}} $; $F_\tau \gg F_{{half}} $ 时, $d_{F} \approx d_{{max}} -d_\tau$. 式(9b) 中, $a_{m} $是细胞膜上Arp2/3密度, $\tilde{{R}}a_{m} $即表征由Rac调控钩端生成. $a_{m} $与胞质游离态Arp2/3 ($a_{c} )$ 相互转化过程由式 (4) 描述, 即: $a_{m} $, $B$, $a_{c} $分别对应于$RL$, $R$, $L$. 后两项中, $k_{b}$, $c$分别是钩端生成及移除的基准速率.

2 数值方法

整体数学模型由平衡微分方程及反应-扩散方程组构成, 属于力学-化学耦合问题, 可采取LBP法求解^[18]. LBP是将LBM与粒子 (particle) 法耦合, 其中LBM程序计算的基本内容是令"迁移"和"碰撞"两个步骤交替循环进行.

(1)碰撞

(10a)${f}'_{v,\alpha } (x,t)-f_{v,\alpha } \left( {x,t} \right)=\varOmega$

(2)迁移

(10b)$f_{v,\alpha } (x+e_\alpha \Delta t,t+\Delta t)={f}'_{v,\alpha } (x,t)$

式(10) 中, $f_{v,\alpha } (x,t)$是定义在离散速度方向集$\left\{ {e_\alpha }\right\}$上的瞬时粒子分布函数; D1Q3 单元的$e_\alpha $取为

(11)$e_{\alpha {}} =\left\{ {{\begin{array}{ll} 0, & {i=0}\\ {\cos ({i\pi} -\pi )}, & {i=1,2}\\ \end{array} }} \right.$

$\varOmega $是碰撞算符, 由反应项 ($\varOmega ^{R})$ 及非反应项 ($\varOmega^{{NR}})$构成, 即: $\varOmega =\varOmega ^{R}+\varOmega ^{{NR}}$.$\varOmega ^{{NR}}$采用单松弛模型

(12)$\varOmega ^{{NR}}=-\frac{\Delta t}{\tau }\left[ {f_{v,\alpha } \left( {x,t} \right)-f_{v,\alpha }^{{eq}} (x,t)} \right]$

$f_{v,a}^{{eq}} (x,t)$是平衡函数

(13)$f_{v,\alpha }^{{eq}} (x,t)=w_\alpha \rho _{v}$

式中, $\rho _{v} $是宏观密度, $w_\alpha $是粒子速度权系数.

LBM具有格式简单、便于并行计算、处理几何边界灵活等优点, 适合求解固定边界下的反应-扩散方程组^[19-20], 前期工作是在计算反应源项时调用 Monte-Carlo (MC) 法, 从而保留系统噪音^[21]. LBP-D1Q3将D1Q3单元与力学单元动态匹配, 即由欧拉法获取粒子位移以更新单元长度, 之后对$f_{{v},\alpha } (\{x_i +e_\alpha \Delta t\},t+\Delta t)$在网格节点$\{x_i \}$上进行3次样条插值, 由此获得$f_{{v},\alpha }(\{x_i \},t+\Delta t)$. 为保证插值前、后总量守恒, 设定分布函数为

(14)$f_{v,\alpha } (x_i ,t+\Delta t)= \\ \qquad f_{v,\alpha } (x_i ,t+\Delta t)\cdot \frac{\sum {\rho _v (t+\Delta t)\Delta x_i (t+\Delta t)} }{\sum {\rho _v (t)\Delta x_i (t)} }$

3 结果

3.1 AJs形成动力学

考察两悬浮态细胞接触后E-cad* , F-actin在接触区域募集的时空动力学, 以此表征AJs形成. 此前Bangasser等针对马达-离合器机制开展参数分析^[22], 本文据此将"马达"参数设定为: $F_{m} =2$ pN, $v_{m} =120$ nm/s, "离合器"参数为: $k_- =0.1 {s}^{-1}$, $k_+ =0.3 {s}^{-1}$. 钩端、E-cad* 及Arp2/3初始值设定为: $B=50$ $\mu$m$^{-1}$^[17], $E_{I} =32$ $\mu$m$^{-1}$^[17], [Arp2/3] = 0.05 $\mu$M^[23]. 细胞力学及F-actin聚合/解聚模块参数见表1.

表1模型参数

Table 1 Model parameters

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图2(a) 是 $t = 20$ (上)、50 s (下) 时细胞形态及E-cad* 分布图. 两细胞在$t = 0$ s接触, 此时E-cad* 均匀分布; 至$t = 20$ s, 两细胞因受到外力 ($F_{{ext},i}$ ) 发生显著挤压, 接触区域Rac梯度信号令Arp2/3局部激活进而产生少量钩端, F-actin聚合速率提升即将少量E-cad* 锚定于此; 至 $t = 50$ s, 细胞已到达平衡位置, 观察到E-cad* 积聚在接触区域, 而Ct 点E-cad*密度由初始约0.3 $\mu$M提升至约0.8 $\mu$M. 由于扩散速率低 ($D_{I} =0.1$ $\mu$m$^2$/s), E-cad*在接触/非接触交界区呈现陡峭梯度.

图2

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图2(a) $t= 20$、50~s时细胞形变及E-cad*分布. $F_{{ext},i}$是沿水平方向施加的节点外力. (b) E-cad*时空调控图. 纵坐标0点是细胞相互接触中心位置

Fig.2(a) Snapshots of cell shape and the distribution patterns of E-cad* at $t = 20$ and 50 s. $F_{{ext},i} $is the external nodal force exerted alone horizontal direction. (b) Spatiotemporal regulation of E-cad*. Point 0 indicates the position of contact center

图2(b)是E-cad* 时空调控图, $[-\pi /3,\pi /3]$是平衡时细胞接触区域. 观察到50 s后E-cad* 依然持续募集至该区域, 直至约6 min达到稳态. E-cad*募集与两细胞接触后产生的动态张力信号密切相关, 即由myosin-II持续地驱动F-actin负向尾流 (retrograde flow)引起胞间E-cad* 成键受拉、传导皮层张力. 张力随着E-cad* 成键数增多而增强, 继续通过减慢F-actin解聚锚定E-cad* , 直至E-cad* 与E-cad相互转化速率动态平衡.

图3(a)是$Ct$点处F-actin密度时程曲线图. 观察到正常情况下 (ctrl组), 活性态Rac梯度促进F-actin聚合同时张力抑制F-actin 解聚, 由此产生互补效果即将F-actin密度提高至约16 $\mu$M, 接近初始时2倍. 在force$^{-}$对照组中, 令$d_\tau =0$ s$^{-1}$以消除张力对F-actin调控, 观察到由Rac梯度单独作用仅使得F-actin积聚密度为约12 $\mu$M; 在cis$^{-}$对照组中, 令$\vartheta =0$ s$^{-1}$以取消E-cad* 的成束效应, 此时F-actin借助少量E-cad*介导的张力信号将自身稳态密度恢复到约14 $\mu$M.

图3

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图3Ct点处F-actin (a)和E-cad* (b) 时程曲线图

Fig.3Temporal evolutions of F-actin (a) and E-cad* (b) at Ct point

图3(b) 是相应的E-cad* 密度时程曲线图. 观察到, ctrl组中E-cad* 在F-actin锚定及自身成束的双重反馈下产生积聚, 其密度增长曲线呈现起始 (0$\sim $30 s)、快速增长 (0.5$\sim $5 min) 及缓慢增长(5$\sim $8 min)三阶段.

在force$^{-}$组中, F-actin密度最低, 因此对E-cad* 锚定量最少, E-cad* 依靠成束将F-actin赋予的初始极性放大, 最终达到约0.6 $\mu$M; 在cis$^{-}$组中, E-cad* 仅依赖与F-actin锚定产生积聚, 稳态时仅为约0.3 $\mu$M.

综上所述并参考迄今少有争议的真核细胞极化理论^[27-30], 针对悬浮态细胞粘附的动力学过程亦可分为"方向感知"与"极化". 细胞接触初期, 接触区域Rac活性及皮层张力的提升为E-cad* 募集指明方向. 两类信号的起效方式不同: Rac信号受制于Arp2/3总量, 它从起效到饱和的周期短, 而张力信号受制于E-cad* 密度, 初始较弱但借助力学反馈回路持续增强. E-cad* 初始极性分布改变了顺式二聚体成束的局部速率, 后者即为"极化"机制, 可引起E-cad向E-cad* 加速转化, 直至E-cad大量消耗而达到稳态. 为定量化两类信号对AJs的调控作用, 后续将改变模型初始条件 (Rac活性或皮层张力) 考察最终E-cad* 信号输出.

3.2 细胞皮层力学属性调控粘着连接形成

此前, 尽管Murrell等^[11]观测到皮层呈现松散的非肌节元 (nonsarcomeric)结构可大幅提高马达分子收缩应变, 但并未阐述皮层力学属性将如何调控AJs建成. 本节即着眼于力学反馈回路启动机制, 继续探究这一问题.

首先取消Rac梯度 (即设定$R_{h} =R_{r} =0.1)$, 考察单独由张力各向异性是否可引起E-cad* 局部积聚.图4(a) 是取$K_1=$1, 10 pN/nm时获得的$Ct$点处$F_\tau $时程曲线图. $K_1=10$ pN/nm时表征皮层呈紧密结构,观察到起始阶段 (0$\sim$100 s), 皮层张力 ($F_\tau )$ 峰值始终较低 (约75 pN). 这是由于$K_1$过大导致E-cad* 键力($F_{{c},i} )$ 快速增长, 键的最概然寿命仅为约1 s (图4(b)), 同时由于键的反复形成与断裂造成$F_\tau $波动. $K_{c} =1$ pN/nm时可指皮层呈松散结构. 较小的$K_1$使$F_{{c},i} $增长较慢, 键的最概然寿命延长为约3 s (图4(b)), 观察到$F_\tau $峰值为约100 pN. 由马达分子持续收缩引起E-cad* 成键受拉使得$F_{{c},i} $逐渐增大, 直至断裂后由其它键分担, 造成键的连锁断裂, 观察到$F_\tau$呈现出周期性"加载-失效" (load-and-fail) 现象^[15]. 随着模拟持续, 400$\sim $500 s阶段"$K_1 =10$ pN/nm"与初期相比未发生显著变化, "$K_1 =1$ pN/nm"则呈现阶梯式上升, $F_\tau $峰值约为150 pN. 由此可见, 皮层为松散结构更加有利于提升皮层张力, 并由此启动力学反馈回路驱动E-cad* 积聚, 最终形成AJs.

图4

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图4(a) $K_{l} $取1, 10 pN/nm时的Ct点张力时程曲线图. (b) E-cad*成键最概然寿命直方图. (c) 单独张力调控下E-cad*时空调控图

Fig.4(a) Time courses of the tension at {Point} Ct at $K_{l} = 1$ and 10 pN/nm. (b) Distribution patterns of the lifetimes of E-cad* bonds. (c) Spatiotemporal regulation of E-cad* in the presence of the tension alone

图4(c)是$K_1 =1$ pN/nm时E-cad* 时空调控图.与图2(b) 对比, 由于缺少活性态Rac梯度, E-cad* 的初始积聚位置并不位于接触中心. 这是由于该阶段张力各向异性程度较低, 不具有明确的E-cad* 积聚信号, E-cad* 通过自身成束效应制造了随机高点. 随着模拟时间推进, 力学反馈回路逐渐开启, E-cad* 积聚方位逐渐向接触中心偏移(图中白色线).

3.3 细胞接触长度调控AJs形成

实验中通过调节双微吸管间距来控制细胞挤压程度^[14], 模拟时施加不同挤压力 ($F_{{ext},i} )$ 即可达到相同效果.图5(a)即考察缺少Rac梯度时, 细接触区弧度由2$pi /$9 扩大至8$pi /$9时获得的稳态E-cad* 分布. 随着接触区扩大, 细胞后部的E-cad* 密度降低. 弧度为2$\pi /$5时, E-cad* 峰值最高 (达到约0.90 $\mu$M), 说明中等长度的接触区促进AJs成熟. 接触区过小时输入的张力信号较弱, 从而限制整体力学反馈回路强度; 接触区过大时高密度E-cad* 分配范围过大导致峰值降低, 同样会限制AJs 成熟.图5(b) 是加入Rac梯度信号($R_{h} =0.3)$ 后的E-cad* 分布. 与图5(a)对比, 细胞前、后部密度与接触区弧度关系依然存在, 但分布更为陡峭.图5(b)插入图是令接触区在 [0, 2.7] 弧度变化时获得的$Ct$点处E-cad*峰值浓度曲线图. 观察到该曲线呈现双相性, E-cad*最高峰值浓度发生在1.2接触弧度附近.

图5

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图5$R_{h}= 0.1$ (a) 或 0.3 (b) 时不同接触长度下的E-cad*稳态分布图. (b) 中的插图显示E-cad*峰值浓度随接触区长度呈双相性变化

Fig.5Profiles of E-cad* at $R_{h} = 0.1$ (a) and 0.3 (b) upon different extrusion deformations. Inserted panel in (b) shows the dependence of maximum E-cad* concentration with the contact length。

图6是将$R_{h} $和$K_1 $进行参数组合获得的E-cad* 稳态分布. 取$K_1 =1$, 5, 10 pN/nm, 同时取$R_{h} =0.1$, 0.3, 0.5, 由此获得9组 ($K_1 $, $R_{h} )$. 由于$F_{{ext},i} $为常量, 细胞挤压程度由$K_1 $控制, $K_1$越大则挤压程度越低. 观察到 (1, 0.5) 组合下E-cad* 呈现显著积聚, 这是由于Rac梯度信号最强, 而$K_1$低可引起接触区扩大、E-cad* 成键寿命延长; 相反取 (10, 0.1) 时, 力学、化学信号均最弱, 使得E-cad* 积聚程度最低. 取 (1, 0.1)、(10, 0.5) 时, E-cad* 积聚程度接近, 说明当张力信号较弱时可由增强局部Rac信号予以补偿, 反之亦然.

图6

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图6$K_{l} $与$R_{h} $进行参数组合所获得的E-cad*稳态分布图

Fig.6Stable distribution patterns of E-cad* derived from different combinations of $K_{l} $and $R_{h} $

4 讨论

生物化学学者开展悬浮态细胞粘附实验往往配合分子抑制/过表达对照组实验. 分子间级联转导如何调控分子在细胞局部积聚动力学? 对于这一细胞-分子"跨尺度"问题需要借助构建力学-化学耦合模型予以回答. 此前Chu等^[14]采用转染E-cad的悬浮态S180细胞开展粘附实验, 通过控制两细胞接触时间并测算分离力 (与E-cad* 积聚程度正相关) 将AJs的建立过程划分为: 起始、快速增长及缓慢增长阶段. 本文数值模拟获得E-cad* 调控空间分布特征及演化趋势与该实验一致, 但达到稳态所需时间较Chu实验快 (约5 min vs. 约30 min), 原因之一是忽略了G-actin自身调控, 即G-actin主要以ADP结合态存在, 需要与捕获蛋白ADF/cofilin, profilin, Thymosin发生交换成为ATP结合态方能供给钩端聚合^[17]. Chu等^[14]所开展的对照组实验包括有: (1) 采用Latrunculin抑制F-actin聚合后, 观测到AJs无法形成; (2) 表达Rac显性失活突变体后, AJs成熟度降低了35${\%}$. 参照本文图6可对上述观测结果作如下解读: 尽管F-actin, Rac都参与E-cad力学反馈回路, 但Rac位于F-actin上游, 其促进F-actin聚合的作用可由张力降低F-actin解聚予以补偿, 因而Rac失活只会削弱但并不阻止AJs建成.

本文为构建整体数学模型采取了必要的假设及简化, 今后可继续开展以下工作. 首先, 模型假设Rac活性系数由细胞接触区以指数形式衰减, 未引入Rac自身调控机制. 此前 Mori等针对Rac (或Cdc42) 调控提出了波桩 (wave-pinning) 模型^[31], 即考察Rac失活/活性态转化, 活性态Rac扩散较慢并正向调控自身生成, 由此造成了其在一侧激活即以波的形式向对侧传播, 最终受到失活/活性态总体质量守恒限制达到稳定的极性分布. 已证实E-cad与整合素(integrin) 通过Rho GTPase发生交互式调控^[32-33], 继续引入Rho GTPase调控模块可将悬浮态细胞粘附模型拓展至贴壁细胞^[34].

其次, 模型对E-cad, F-actin力学传导结构是采取"最弱结合点"假设^[15], 将胞间E-cad* 成键作为一系列"串联弹簧"的失效点, 将其考虑为滑移键(slip bond). 此前原子力显微镜、光镊等单分子实验证实了cadherin-catenin复合体与F-actin或是胞间E-cad* 成键均存在逆锁键 (catch bond)^[35-36]. 基于本文力学-化学耦合体系, 后续可从力学反馈回路的启动机制出发, 探讨逆锁键对AJs的调控作用.

最后, 本文通过LBP法求解包含级联信号转导的细胞力学问题, 未考察细胞与环境流体间相互作用. 此前Dallon等^[25]基于浸入式边界法 (immersed boundary method, IBM) 构建了悬浮态细胞粘附的流体-固体耦合模型; Tanaka等^[37]将IBM与LBM结合并应用于组织形态发生 (morphogen) 领域. 受此启发, 今后可发展IB-LBP法.

5 结论

本文考察胞间E-cad* 成键介导actomyosin皮层上的Rac活性及张力信号反作用于E-cad级联转导, 由此构建了悬浮态上皮细胞粘附的力学-化学耦合模型, 并通过自行发展的LBP-D1Q3法予以数值求解. 正常组数值模拟首先重现了细胞粘附实验中观测到E-cad* 和F-actin在细胞接触区持续募集的现象, 继而结合对照组获得了以下3方面主要结论.

(1) 局部活性态Rac、张力信号分别调控F-actin聚合、解聚, 由此发挥互补效应造成F-actin在细胞接触区域富集, 通过锚定作用帮助E-cad* 建立初始极性; E-cad* 通过形成顺式二聚体将初始极性放大, 由此E-cad* 时程曲线呈现起始、快速增长及缓慢增长阶段.

(2) 单独张力各向异性经"E-cad $\to$ 张力 $\to$ F-actin"力学反馈回路放大即可造成E-cad* 积聚; 在马达分子拉动下, E-cad* 成键寿命与皮层刚度相关, 而松散的皮层结构具有较小刚度, E-cad* 成键寿命延长、张力提升, 有利于力学反馈回路的启动.

(3) 细胞接触区长度适中时, 整体张力输入信号经力学反馈回路放大使得E-cad* 局部积聚最为显著, 因此接触区长度可作为控制粘着连接成熟度的有效手段.

致谢

感谢宁波大学王骥教授、杜建科教授在本文撰写过程中给予的建议.